AAmerican Diagnostica GmbH,ADI 公司

Freee Protein S ELISA (Cat.no 842)中文說明書

                                         （中文說明書供參考，請以英文說明書為準）

簡介，檢測原理（略）

試劑盒組成：

1. 96孔板
2. 2瓶Protein S 樣品稀釋液，即用型50ml
3. 3瓶Protein S校準品
4. 1瓶Protein S高值質控
5. 1瓶Protein S低值質控
6. 3瓶抗人Protein S-HRP 二抗
7. Protein S二抗稀釋液（15ml）
8. 1瓶，20X洗滌液(50ml)
9. 1瓶TMB底物溶液 （25ml）
10. 1瓶終止液（6ml）

試劑準備和保存

1. 微孔板：鋁鉑拆開后，板條應該在30min內使用。不用的板條按2-8℃在原包裝袋內（含干燥劑）密封，防潮可保存4周。
2. Protein S樣品稀釋液：即用型，一旦開蓋，2-8度可穩定4周。
3. 校準品：每瓶校準品，用Protein S 樣品稀釋液2ml重懸。校準品含量相當于正常血漿1:50稀釋后的量。重懸后的校準品室溫（18-25℃）可保存8小時。
4. Protein S Control I：用濾過的去離子水0.5ml重懸該質控品。重懸后的質控品室溫（18-25℃）可保存8小時，2-8℃可保存24小時，-20℃無菌條件可保存2月。
5. Protein S Control II：用濾過的去離子水0.5ml重懸該質控品。重懸后的質控品室溫（18-25℃）可保存8小時，2-8℃可保存24小時，-20℃無菌條件可保存2月。
6. Mab anti-Human Free Protein S-HRP：用4ml Protein S Conjugate Diluent，重懸該抗體。輕搖，重懸后的二抗室溫可保存24小時，2-8度可保存4周以上。
7. Protein S Conjugate Diuent：即用型，開蓋后，2-8度可保存4周以上。
8. Protein S Wash Solution：如果瓶內有沉淀或固體物質，37度水浴15-30min，輕搖瓶管，1:20用雙蒸水稀釋(50ml，稀釋后可制備1L的稀釋液)原管內2-8度保存，開蓋后后保存4周，稀釋后的稀釋液，2-8度可保存7天。
9. TMB顯色底物：即用型，一旦開蓋，2-8度可保存4周以上。
10. 終止液（0.45M H2SO4）：即用型。

樣品收集和制備

檸檬酸抗凝的血小板缺乏的血漿或血清適用于該實驗。

血漿按以下方式制備：

1. 按血：檸檬酸鈉（3.2%）=9:1的比例，收集樣本
2. 2500g 離心20min
3. 血漿需2-8度保存，4小時內做檢測。或血漿保存于-20度，6個月內檢測。
4. 凍的血漿需37度，迅速解凍。解凍的血漿2-8度保存，4小時內做檢測。

檢測的樣本和Protein S control需用protein S 樣品稀釋液1:50稀釋，如果樣品濃度可能高于100%，需做高濃度稀釋。如果樣本濃度x＜10%，樣本只需做小于1:50低濃度稀釋

校準品制備

Free Protein S 濃度以占血漿百分比（%）表示，。100% Free Protein S濃度相當于：正常血漿（混合池）1:50稀釋后的濃度。

按一下方式制備校準品：

充分混勻，標準品稀釋液室溫穩定性至少4個小時（18-25℃）

操作流程：

1. 依據做的標本數量，拆去多余的板條，置于提供的板條架上。
2. 剩余檢測孔，按以下操作流程操作。

注意：

1. 在孵育的時候，特別是顯色的時候，避免微孔板強光照射。
2. 在加入試劑前或洗滌前，不要使板干透。隨后加入的時間應在3min內完成，避免微孔板太干燥。如果已干燥，在加入新試劑前，需加入洗滌液，然后去掉。
3. 每排板孔，加入TMB底物的時間間隔需要測定。終止時間要相同

結果：

以Protein S 標準品濃度（%）做橫坐標，平均吸光度做縱坐標，每次檢測都需要重新做標準曲線，如圖所示。

計算：

從曲線可直接計算出ProteinS 的濃度（樣品按：1:50稀釋）。如果樣品做了高濃度的稀釋，需乘以對應稀釋系數D(例如：樣本做了1:100稀釋后，測值需乘以2，1:200稀釋后，測值需乘以4) 。如果做低濃度的稀釋，得到的檢測值需除以稀釋倍數。

檢測程序的局限性：

因為盒子內的單抗是鈣依賴性單抗，所以請用盒子里自帶的Wash Buffer (含鈣)。如果洗滌不充分，得到的樣品檢測OD值會很高，為避免非特異性顯色，請確保洗滌的充分性。

測值：
血漿中Protein S 濃度正常值：60-150%，因此非正常值＜60%。一般男性測值會高于女性，且隨年齡和血脂濃度增加。