Peprotech重組細(xì)胞因子和蛋白-常見問題解答(FAQ)

1．PeproTech細(xì)胞因子和蛋白產(chǎn)品的穩(wěn)定性如何？
     答：除非在產(chǎn)品說明書中特別注明，PeproTech的所有產(chǎn)品均為凍干粉，它們在室溫條件下非常穩(wěn)定(至少1個(gè)月)。盡管如此，我們還是建議您在收到我們的產(chǎn)品后保存于-20℃，以確保蛋白100%的活性。對(duì)于大多數(shù)蛋白，重懸后在4℃僅能短期保存(約1周)。如想長期保存，請(qǐng)先配制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白，如0.1% BSA，5%HSA，或10% FBS)，然后分裝凍存于-20℃或-80℃。一定要避免反復(fù)凍融，因每次凍融均會(huì)引起蛋白的部分失活。。

2．為什么有時(shí)在管中看不到細(xì)胞因子或蛋白的凍干粉？
      答： 與市場上的許多蛋白產(chǎn)品不同，PeproTech的產(chǎn)品中均不含載體蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA)和蔗糖等，并且是以zui低含鹽量的溶液進(jìn)行凍干的，因此凍干后常常不能形成白色網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而是微量的蛋白在凍干過程中沉積在管內(nèi)，形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。打開管蓋前，我們建議您在小離心機(jī)中快速離心20-30秒，使附著在管蓋或管壁上的蛋白聚集于管底。我們的質(zhì)控步驟保證每管中所含的蛋白量準(zhǔn)確無誤，雖然有時(shí)您無法看到蛋白色粉末，但管中的蛋白含量仍是非常的。

3．ED₅₀和units/mg之間有何關(guān)聯(lián)？
      答： ED₅₀為半數(shù)有效濃度，其定義是可誘導(dǎo)50%zui大反應(yīng)的細(xì)胞因子濃度，這種活性表示法僅適用于劑量反應(yīng)曲線呈S形的細(xì)胞因子。其實(shí)，可以將ED₅₀的值接理解為1unit。如某種細(xì)胞因子或蛋白的ED₅₀為1ng/ml，那么1ng/ml即可看作是1unit。那么我們也不難理解，1mg(1x10⁶ng) 該細(xì)胞因子或蛋白中應(yīng)含1x10⁶/1= 10⁶units. ED₅₀(ng/ml)轉(zhuǎn)化為units/mg的公式如下：

 

4．如何確定細(xì)胞因子的種屬交叉活性？
    答：1) 除少數(shù)例外，大多數(shù)人類細(xì)胞因子對(duì)小鼠細(xì)胞均有活性。2) 許多小鼠細(xì)胞因子也可作用于人類細(xì)胞，但比活性可能低于對(duì)應(yīng)的人類細(xì)胞因子。 3) IL-7等為數(shù)不多的人類細(xì)胞因子作用于小鼠細(xì)胞時(shí)比對(duì)應(yīng)的小鼠細(xì)胞因子活性更強(qiáng)。4) 干擾素，GM-CSF, IL-3和IL-4等細(xì)胞因子種屬特異，對(duì)非同源細(xì)胞幾乎沒有活性。5) 相反，成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)和神經(jīng)營養(yǎng)素(neurotrophins)高度保守，在不同動(dòng)物種屬細(xì)胞上均具有很好的活性。

5．到底什么是無動(dòng)物成分(Animal-Free)的重組蛋白？
      答：誠然，PeproTech生產(chǎn)的重組蛋白均是人或小鼠和大鼠的，又怎么說成是Animal-Free，即無動(dòng)物成分的呢？真正的原因是：這里的Animal-Free是指在表達(dá)人、小鼠或大鼠的重組蛋白的過程中未使用任何動(dòng)物來源的材料，而不是指被表達(dá)的重組蛋白是Animal-Free的。我們知道，重組蛋白通常是用大腸桿菌表達(dá)的，而大腸桿菌的培養(yǎng)基中需要添加胰蛋白胨(Trypton)等動(dòng)物來源的組分，這些組分不可避免的在隨后表達(dá)出來的重組蛋白中摻入諸多不明的動(dòng)物成分。雖然zui后純化出來的重組蛋白的純度可達(dá)98%或99%，但另外1%中很可能含有來自胰蛋白胨的其它動(dòng)物成分，這些動(dòng)物成分雖然含量極微，但可能在重組蛋白應(yīng)用于人體或動(dòng)物時(shí)，將其中所含動(dòng)物病原體(如瘋牛病病毒及其它未知病原體)傳染給人和動(dòng)物。而且，這些動(dòng)物成分中的異源蛋白也會(huì)引起人和動(dòng)物的異體排斥或過敏反應(yīng)。因此，當(dāng)重組蛋白在應(yīng)用過程中可能接觸到人體或動(dòng)物體時(shí)(如細(xì)胞治療和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等)，請(qǐng)盡量選用Animal-Free的重組蛋白。

 PeproTech的無動(dòng)物成分重組蛋白是在獨(dú)立的*無動(dòng)物成分的生產(chǎn)車間中生產(chǎn)出來的，同時(shí)生產(chǎn)過程中不會(huì)使用到胰蛋白胨等任何含動(dòng)物成分的培養(yǎng)基或試劑，因此可保證zui終的重組蛋白中不含任何動(dòng)物成分，非常適合于臨床前試驗(yàn)和動(dòng)物研究。

 PeproTech的無動(dòng)物成分產(chǎn)品的產(chǎn)品編號(hào)均以AF為前綴。PeproTech現(xiàn)已有44種無動(dòng)物成分的人、小鼠和大鼠重組蛋白，并在不斷快速增加。而且有些常用的細(xì)胞因子，如人EGF(表皮生長因子)已經(jīng)*采用無動(dòng)物成分的生產(chǎn)方式，即不再提供含動(dòng)物成分的人EGF。

PeproTech細(xì)胞因子和重組蛋白溶解必讀（一）

我們知道，PeproTech的所有細(xì)胞因子和蛋白均為凍干粉，這使得運(yùn)輸非常便捷，只要常溫即可。而且，細(xì)胞因子和蛋白凍干粉非常穩(wěn)定，在-20^℃或-80^℃條件下可保存數(shù)年。凍干粉在使用前需進(jìn)行溶解，然后以液體形式加到培養(yǎng)體系或注射入動(dòng)物體內(nèi)。溶解步驟非常關(guān)鍵，因溶解不好會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子或蛋白的失活，這也是很多用戶在實(shí)際使用中經(jīng)常遇到的問題。
       那么，應(yīng)該如何進(jìn)行正確的溶解呢？
      下面我們以Recombinant Human IL-4 (重組人IL-4，產(chǎn)品編號(hào)：200-04)的說明書為例，對(duì)細(xì)胞因子或蛋白的溶解方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述。
       拿到重組人IL-4的說明書后，您會(huì)發(fā)現(xiàn)有一段關(guān)于Reconstitution(重懸)的敘述，這段內(nèi)容含有溶解相關(guān)的所有信息。
    1. Centrifuge the vial prior to opening
          第1步：開蓋前離心試劑管
          PeproTech的細(xì)胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中，為無菌包裝。凍干粉在運(yùn)輸過程中可能會(huì)因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉*溶解。

     有很多用戶會(huì)問一個(gè)問題，即應(yīng)該用多少轉(zhuǎn)速、多長時(shí)間離心試劑管，才能達(dá)到良好的收集效果？
          答：有些小型高速離心機(jī)(多為進(jìn)口品牌)的面板上有一個(gè)Spin鍵，按了此鍵后，離心機(jī)會(huì)自動(dòng)快速上升到其zui大速度(10000rpm或12000rpm)，上升到zui高點(diǎn)后速度即刻下降，直至停止旋轉(zhuǎn)，整個(gè)過程大約30s。這個(gè)Spin鍵足以很好的將細(xì)胞因子或蛋白收集到管底。但有些實(shí)驗(yàn)室沒有這樣的高速離心機(jī)，只有zui高轉(zhuǎn)速為4000-4500rpm的離心機(jī)。這種情況下，需3000-3500rpm離心5min，也能達(dá)到類似的效果。
    
     2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do notvortex.
           第2步：用無菌水重懸至0.1-1.0 mg/ml，不可振蕩。 這個(gè)步驟即為溶解步驟，非常重要。
     1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉
      用于溶解細(xì)胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人IL-4需用水溶解，而重組人IL-2 (產(chǎn)品編號(hào)：200-02)則需用100mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重組人TGF-beta1(產(chǎn)品編號(hào)：100-21)需用10mMCitric Acid (檸檬酸)，pH3.0溶解，重組人FGF-basic(產(chǎn)品編號(hào)：100-18B)需用5mMTris，pH7.6溶解，重組人FGF-10(產(chǎn)品編號(hào)：100-26)需用5mMSodium Phosphate(磷酸鈉)，pH7.4溶解，重組IL-13(產(chǎn)品編號(hào)：200-13)需用20mMMHCl溶解。(注：即使同一重組細(xì)胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。具體應(yīng)該如何溶解應(yīng)以相應(yīng)批次的說明書為準(zhǔn))。后續(xù)的文章中將對(duì)各種溶解液的配制方法進(jìn)行詳細(xì)的闡述，望繼續(xù)關(guān)注。
          經(jīng)常有用戶會(huì)問，為什么會(huì)有這么多種溶解方法？
          答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強(qiáng)度。PeproTech的細(xì)胞因子或重組蛋白在出廠前均經(jīng)嚴(yán)格測試，說明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白*溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強(qiáng)度與說明書中所標(biāo)明的不符，很多時(shí)候會(huì)造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能*溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。 
           有不少用戶沒注意說明書上的描述，而是根據(jù)習(xí)慣，直接用PBS或培養(yǎng)液(1640或DMEM等)等溶解細(xì)胞因子或蛋白的凍干粉。這樣做可以嗎？
           答：有時(shí)可以，要看具體情況。PeproTech的大多數(shù)細(xì)胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是PBS，此時(shí)千萬不能用PBS或培養(yǎng)液直接來溶解，具體原因在上面已經(jīng)敘述過。而有部分細(xì)胞因子，如重組人KGF(產(chǎn)品編號(hào)：100-19)和重組人FGF-23(產(chǎn)品編號(hào)：100-52)等，說明書上的溶解液即為1x PBS，此時(shí)用PBS溶解*沒問題，那么用培養(yǎng)液溶解也是可以的，不過還是用先用PBS溶解，然后再用培養(yǎng)液稀釋。
          2) 一定要溶解到的濃度。
              蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個(gè)范圍就是說明書上所標(biāo)明的濃度范圍，該例為0.1-1.0mg/ml。這個(gè)濃度范圍對(duì)于不同的細(xì)胞因子或重組蛋白是不同的。如重組人FGF-6(產(chǎn)品編號(hào)：100-30)為0.5-1.0mg/ml，而重組人ActivinB(產(chǎn)品編號(hào)：120-15)則一定要是0.5mg/ml。
            高于或低于該濃度范圍會(huì)有什么問題呢？
             答：首先，細(xì)胞因子或蛋白會(huì)不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個(gè)濃度范圍，可能會(huì)超過該蛋白的zui大溶解濃度，即蛋白無法*溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會(huì)出現(xiàn)聚集(aggregation)，zui終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。
          3) 一定不能振蕩(vortex)。
             這里所說的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。
            有用戶會(huì)問，若想保證溶解液與凍干粉充分混勻，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子或重組蛋白的*溶解，該怎么辦呢？
             答：多數(shù)細(xì)胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細(xì)胞因子或重組蛋白*溶解。
             對(duì)于不易溶解的細(xì)胞因子或蛋白，PeproTech會(huì)在說明書中進(jìn)行備注(Note)。如在重組人IL-13(產(chǎn)品編號(hào)：200-13)的說明書中您會(huì)看到：Slow todissolve (緩慢溶解)，在重組人IL-11(產(chǎn)品編號(hào)：200-11)的說明中會(huì)看到： Thissolution is slow to dissolve.(該溶液溶解緩慢)。這種情況下，您能將要溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白放在水平搖床(shaker)上低速搖一段時(shí)間，促使細(xì)胞因子或重組蛋白*溶解。
           有些蛋白，如重組人IL-13 Variant (產(chǎn)品編號(hào)：200-13A)雖然難溶，但卻不需用搖床來加速溶解。其說明書上的備注為：Allowthe reconstituted vial to sit at 4℃ for at > 2 hours before use. (將重懸液在4℃靜置2小時(shí)以上)
          
         3. This solution can be stored at 2-8^℃ for up to 1week.         
              第3步：該重懸液在2-8^℃zui長可保存1周。
           用說明書上推薦的溶液將細(xì)胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細(xì)胞因子或重組蛋白可放置在2-8^℃，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細(xì)胞因子或重組蛋白的活性zui長可保持1周。這對(duì)一個(gè)周期為5-7天的實(shí)驗(yàn)，如DC(樹突狀細(xì)胞)的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。
         其實(shí)，說明書上推薦的濃度對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)來講是比較高的。所以用戶通常會(huì)將該溶液進(jìn)一步稀釋后再放在4^℃保存，待1周內(nèi)用完。如進(jìn)行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進(jìn)行稀釋，否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很容易會(huì)粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度下降，細(xì)胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。
       
        4. For extended storage, it is recommended to further dilute in abuffer containing a carrier protein (example 0.1% BSA) and store in workingaliquots at -20^℃ to -80^℃.
              第4步：如要長期保存，則需用含載體蛋白(如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA)的溶液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20^℃至-80^℃。
            如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期長于一周，或配制的細(xì)胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對(duì)細(xì)胞因子或重組蛋白進(jìn)行長期保存。方法是：將已重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1%BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20^℃至-80^℃，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。
          經(jīng)常有人會(huì)在細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后直接分裝凍存于-20^℃至-80^℃，這樣可以嗎？
           答：不行。我們知道，塑料管壁對(duì)多數(shù)蛋白均有很好的吸附作用，也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后，蛋白是很難與管壁分離的。做過ELISA實(shí)驗(yàn)的人都知道，ELISA的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶標(biāo)板上的。
     載體蛋白，如1% BSA，10% FBS(胎牛血清)和5% HSA等 的主要作用是預(yù)先封閉塑料管壁上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，使細(xì)胞因子或重組蛋白不會(huì)粘附于管壁。如果在細(xì)胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白 的溶液進(jìn)一步稀釋，而直接分裝凍存，則溶液中的大部分細(xì)胞因子或重組蛋白均會(huì)粘附到管壁上，導(dǎo)致溶液中實(shí)際溶解的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度大為降低，zui終 表現(xiàn)為細(xì)胞因子或重組蛋白活性的下降。
       因此，在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋。稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細(xì)胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。
         那么，含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢？水可以嗎？
          答：水不可。該溶液通常是指pH近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如PBS，培養(yǎng)液(RPMI1640, DMEM等)等。
          還有一個(gè)經(jīng)常被問及的問題，即在做無血清培養(yǎng)或動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞因子中不能含有BSA，FBS或HSA等動(dòng)物或人的蛋白，要想長期保存細(xì)胞因子或重組蛋白該怎么辦呢？
         答：一種方法是訂購PeproTech的小包裝(size A)細(xì)胞因子或重組蛋白，每次使用一只，用后即廢棄。如覺得該方法過于浪費(fèi)，則可用海藻糖(Trehalose)作為載體，用含海藻糖的溶液來稀釋已重懸的細(xì)胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。
   
         總之，為保證細(xì)胞因子或重組蛋白凍干份在重懸后仍能保持良好的生物活性，必須按照說明書中Reconstitution的方法嚴(yán)格操作。
         蛋白有價(jià)，實(shí)驗(yàn)無價(jià)，愿大家珍惜每次實(shí)驗(yàn)機(jī)會(huì)，嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真，每次均能得到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果！